Kĩ thuật Fish

A. GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH.

     FISH  là  một  kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụng hiến cứu hữu hiệu nhất.

docx 31 trang thamphan 29/12/2022 940
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Kĩ thuật Fish", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • docxki_thuat_fish.docx

Nội dung text: Kĩ thuật Fish

  1. oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở-20OC trong tối khoảng vài tháng. Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất bởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’ của đầu dò, hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò . Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp .Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu huỳnh quang. Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn. Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang . Độ nhạy của FISH còn có thể được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu. Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng 5
  2. Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e)(Moter et al., 2000). Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA). Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công khi dò tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria(Hình 2e) . Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉlai một lần duy nhất. Cùng với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều dải cũng có thể được sử dụng. Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây, nhem màu. Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử dụng để dò tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít. 7
  3. đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa. Thông thường một lượng dung dịch formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại vi khuẩn Gram âm. Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn hợp ethanol/formalin (tỉlệ9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thông dụng nhất; ngoài ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò. Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, các quá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các đầu dò đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được ngâm trong dung dịch keo lạnh. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề có bất cứ quá trình tiền xử lý nào. 1.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào một mặt kính. Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính ngoài. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin , poly-L-lysine hay các hợp chất tạo muối. Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt nhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ 9
  4. hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay đoạn mô. . Hình 4. Kính hiển vi quét laze đồng tiêu 11
  5. 2.1.2. Đầu dò thiếu tính đặc hiệu Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của các đầu dò oligonucleotide. Thiết kế cẩn thận và đánh giá giới hạn của các đầu dò mới là điều thiết yếu. Điều quan trọng cần lưu ý rằng mỗi một oligonucleotide chỉ phù hợp với duy nhất một dữ liệu thông tin mà nó có chung nguồn gốc. Do sự báo cáo thiếu chính xác thông tin của các trình tự và sự mở rộng nhanh chóng của cơ sở dữ liệu, nên các trình tự đầu dò cần được kiểm tra một cách thường xuyên để cập nhật các thông tin mới nhất. Khi phân lập các vi sinh vật khó nuôi cấy hoặc chưa biết môi trường đặc hiệu, việc cập nhật thông tin các trình tự tỏ ra rất hữu ích để kiểm tra tính đặc hiệu trước khi lai thử nghiệm như các phương pháp lai dot-blot 2.2. Kết quả âm tính 2.2.1. Số lượng đầu dò quá ít Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập không đủ của đầu dò vào bên trong tế bào vi khuẩn. Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinh vật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào. Đối với vi sinh vật gram dương, đặc biệt là những đầu dò có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụng các acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thiết. 2.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên không phải tất cả các chuỗi trình tự đích đều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng. Cấu trúc vòng hoặc kẹp tóc cũng như sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của các đầu dò oligonucleotide. Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong các phương pháp lai thông thường có giai đoạn biến tính RNA hoặc DNA đã không cho kết quả khả quan trong FISH. Một hệ thống nghiên cứu nhằm giải quyết 13
  6. III./ Biện pháp khắc phục Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âm tính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn. Nếu tiến hành lai với một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định, sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn không còn là chỉ số hạn chế. EUB338 là đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này. Tuy nhiên, các phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này . Vì vậy, sử dụng một tập hợp nhiều đầu dò vi khuẩn là điều rất cần thiết có một cái nhìn toàn diện hơn khi phân tích các quần thểvi khuẩn phức tạp. Để kiểm soát những liên kết không đặc hiệu giữa các đầu dò của vi khuẩn nhân thật với 16S rRNA đích hay với các thành phần khác của tế bào so với acid nucleic, việc bổ sung đầu dò có tên là NON338 có thể được sử dụng và nó không phải đưa ra bất cứ tín hiệu nào trong FISH. 15
  7. II. Vi khuẩn cộng sinh Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được. Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài. Việc khoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH có thể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991) đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi Holosporatrên lông của Paramecium caudatum. Từ khi loài Holospora được tìm thấy trong nhân của các vi sinh vật có lông mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn. Tương tự, FISH cũng được sử dụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila, một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến loài Rickettsia. Gần đây, những vi khuẩn nội cộng sinh mới cũng liên quan đến Rickettsia, điều này đã được chứng minh trên các loài Acanthamoeba[44]. Có một điều thú vị là các giống amip tương ứng đều đã được phân lập từ các lớp mô mỏng giác mạc người. Sarcobium lyticum, một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến chi Legionella, cũng đã được chứng minh có trong amip được lấy từ mẫu nước bọt của bệnh nhân viêm phổi. Những chứng minh này cho thấy rằng amip không những được xem là nguồn gây bệnh cho con người mà còn là vật truyền cho nhiều loại vi khuẩn cộng sinh khác nhau. Đây có thể là những trường hợp các vi khuẩn nội cộng sinh không bắt buộc như Legionella pneumophila đã được tìm thấy trong tế bào Acanthamoeba castellani và trong Tetrahymena pyriformiscó lông Trong các môi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae có thể sống sót nhưng ở trạng thái vô hoạt, trong đó chúng không bị phát hiện bằng các kỹ thuật nuôi cấy thông thường. Phục hồi những tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động 17
  8. khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng của viêm răng. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái của chúng. Hình 6. Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng. (a) lai với các đầu dò vi khuẩn là EUB338 gắn nhãn FITC (xanh lá cây) để hiển thị hình thái khác nhau của vi khuẩn ở cấp độ đơn bào và TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dò tìm các loài phát sinh thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa được nuôi cấy. (b) trên cùng một đối tượng, tiến hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây) và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) dò tìm xoắn khuẩn trong khoang miệng thuộc các loài phát sinh nhóm II . Cần lưu ý rằng sự phân loại xoắn khuẩn theo các nhóm phát sinh loài dựa trên những dữ liệu của rRNA 16S . Hình 7. FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I. (a) độ phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3. 19
  9. hiệu của 23S rRNA. Trong nghiên cứu này, các tế bào E.coli được quan sát trong chất nhờn nằm trên các tế bào biểu bì mà không hề có sự gắn kết trực tiếp nào đến các tế bào này . Các xoắn khuẩn của loài Brachyspira/Serpulina đã được hiển thị chính xác trong ruột lợn mắc bệnh lỵ (Boye et al., 1998). Brachyspira pilosicoly xâm nhập và định cư trên các bề mặt tế bào biểu bì và các tiểu nang của lợn đã được tiêm phòng. Một nghiên cứu tương tự cũng đã được thực hiện để kiểm tra sự ảnh hưởng của những vi khuẩn hình que gây bệnh viêm phổi trong quá trình xâm lấn vào ruột già của chuột. Trong một nghiên cứu khác khi thí nghiệm trên chuột bị nhiễm bệnh, Nordentoft và cộng sự (1996) đã cố gắng thiết lập một chẩn đoán bằng phương pháp FISH phát hiện ra chủng Salmonella. Do sự tương đồng về trình tự, nên 16S rRNA hầu như không phân biệt được các chủng thuộc loài Enterobacteriaceae. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã sử dụng một trình tự lấy từ rRNA 23S sử dụng như một trình tự đích cho các đầu dò đặc hiệu phát hiện ra 49 trong 55 chủng gây bệnh thuộc Salmonellanhưng không có loài nào trong 43 loài khác được nghiên cứu thuộc chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae. Salmonellacũng được phát hiện trong các đoạn mẫu parrafin của ruột kết và mô phổi bị nhiễm bệnh của chuột cũng như từ động vật đã từng bị nhiễm salmonella. 3.1.3. Nhiễm khuẩn đường hô hấp Haemophiolus influenzaelà nguyên nhân chung cho bệnh viêm đường hô hấp cấp và mãn tính. Khi sử dụng FISH, các dòng vi khuẩn H.influenzae đã được tìm thấy trong các mô hạch nhân ở họng của trẻ em trong giai đoạn xuất hiện triệu chứng. Vi khuẩn còn được phát hiện trong các đại thực bào, như các lớp tế bào dưới biểu mô. Các nhà khoa học đã cùng nghiên cứu và phát hiện ra các tế bào nhiễm bệnh này khi sử dụng FISH để dò tìm Haemophilusvà sử dụng chất miễn 21
  10. được rằng một biến thể nhỏ của S. aureus có thể tồn tại trong một dòng tế bào nội mạc người. Trong cùng một nghiên cứu, S.epidermidis được phát hiện có trong phần parrafin của mẫu mô liên kết trên một bệnh nhân nới lỏng khớp hông. 3.2.2. Môi trường máu Gần đây, khả năng ứng dụng của FISH để định danh các vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu máu nhiễm bệnh đã được khảo sát bởi 2 nhóm . Bảng trình tự gen và các đầu dò oligonucleotide sử dụng đặc hiệu cho từng loài đã bao quát hầu hết các mầm bệnh điển hình được tìm thấy trên các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn, bao gồm staphylococci, streptococci, enterococci, Enterobacteriaceaevà nấm. Các nhà nghiên cứu kết luận rằng phương pháp FISH có độ nhạy và đặc hiệu tuyệt vời và kết quả thu được chỉtrong 25 phút cho tới 2.5 giờ, trái lại định danh các loài bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống thường mất từ 24 đến 72 giờ mới hoàn thành. Sự phát hiện nhanh chóng các nguyên nhân mầm bệnh trong máu cho phép ta dễ dàng đưa ra được các phương pháp trị liệu thích hợp, vì thế ta có thể hoàn thiện việc chẩn đoán cho các bệnh nhân bị nhiễm trùng máu. 3.3. Nấm Các mầm bệnh có nguồn gốc từ nấm như Candida là những mối đe dọa thường xuyên cho các bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Việc chẩn đoán các mầm bệnh bắt đầu gặp phải một số khó khăn từ khi các tác nhân gây bệnh trong máu thường vẫn biểu hiện âm tính. Bởi vì khả năng nhạy cảm của các tác nhân kháng nấm thì khác nhau trong loài Candida, nên một phương pháp định danh nhanh và nhận dạng chính xác là điều mà các nhà khoa học mong muốn. Bất chấp hiện tượng tựphát huỳnh quang (đã được thảo luận ở trên), C.albicans/tropicalis và C. parapsilosis đã được phát hiện một cách chính xác khi tiến hành đông lạnh các cơ quan nội tạng, 23
  11. này là điều rất quan trọng để kiểm soát và triệt tiêu mầm bệnh này. Phép chẩn đoán đã được nâng cao bằng việc ứng dụng phương pháp FISH - sử dụng rRNA 16S làm đầu dò và sau đó kích thích phát huỳnh quang bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với dòng tế bào trên, vì hai chỉ tiêu độc lập này giúp ta chắc chắn rằng việc nhận dạng là chính xác. Ralstonia solanacearum, một loại vi khuẩn về mặt di truyền có liên hệ rất gần với chủng Pseudomonas, là một tác nhân gây bệnh mục héo hoặc hóa nâu ở khoai tây. Tiến hành xác định mầm bệnh này bằng FISH, rRNA 23S được thiết kế để sử dụng làm đầu dò. Kết hợp với kích thích phát huỳnh quang gián tiếp bằng cách sử dụng một kháng thể đa dòng của Ralstonia solanacearum,việc nhận dạng các vi khuẩn trong đất, trong các mẫu nước hay trong các mô bị thối của cây cà độc dược là điều hoàn toàn có thể làm được . D. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH I. Trên thế giới FISH là một phương pháp dò tìm nhanh chóng, rẻ tiền và dễ dàng thực hiện. Nó đặc biệt hữu ích khi dò tìm các vi khuẩn phát triển chậm, khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy. Nếu được áp dụng trên các mẫu máu hoặc dịch não tủy, nó có thể chẩn đoán nhanh và chính xác mức độ nhiễm trùng của các bệnh nhân bệnh nặng. Một bước quan trọng trong việc nhận dạng lâm sàng vi sinh vật sẽ được thực hiện nếu FISH có thể được tiến hành tự động. Hệ thống phân tích hình ảnh tự động đã được thử nghiệm. Tuy nhiên, việc tự động hóa trong xử lý mẫu cũng như kiểm soát hợp lý các kết quả bằng cách sử dụng các hệ thống chuyên môn luôn được yêu cầu. Một hệ thống các công cụ lai tạo đã được tạo ra, nhưng chúng đã không được sử dụng trên bất cứ mẫu vi sinh vật nào cả. Bên cạnh sự giảm bớt những thao tác 25
  12. thời để nhận biết Bacteroides fragilistrộn lẫn với E.colibằng kính hiển vi . Các đầu dò vi khuẩn hay đầu dò đặc hiệu cho các loài cụ thể đã được sử dụng cho FISH, sau đó tiếp tục xử lý bằng kháng thể đơn dòng hay huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc hiệu cho một kháng nguyên chung của B.fragilis. Bởi vì cường độ tín hiệu phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, vào giai đoạn tiền xử lý và các bước rửa trong suốt quá trình, nên các nhà khoa học đã cho rằng sự kết hợp của hai kỹ thuật mang ý nghĩa nghiên cứu hơn là một công cụ chẩn đoán. Tuy nhiên, nhận dạng tại chỗ vi sinh vật kết hợp với phân tích các biến thể kháng nguyên nhưng không có nuôi cấy có thể giúp hiểu rõ cơ chế gây bệnh của vi khuẩn. Một kỹ thuật để phân tích các độc tố đã được phát triển bởi Warner và các cộng sự (1998). Thông thường, khi tiến hành FISH với một đầu dò định hướng vào rRNA 16S để xác định các vi khuẩn Listeria monocytogenes được kết hợp với phát hiện tại chỗ mRNA của các gen xâm nhập protein, mã hóa cho một độc tố trong cùng một loài. Do sự không ổn định và số lượng bản sao của mRNA thấp hơn rRNA, nên một kỹ thuật FISH với độ nhạy cao đã được phát triển. Các đầu dò polyribonuclotide đối nghĩa, bên trong có gắn nhãn digoxygenin trong phiên mã ngược, đã được lai với toàn bộ tế bào và phát hiện bởi kháng thể có gắn nhãn HRP chống DIG và hệ thống TSA phát huỳnh quang như mô tả ở trên. Kỹ thuật này khá phức tạp và phải được tối ưu hóa cho từng loài mới. Tuy nhiên, đây là một công cụ đầy hứa hẹn cho nghiên cứu biểu hiện gen tại chỗ trong những môi trường phức tạp. Gần đây, một phân tử chỉ thị huỳnh quang, protein huỳnh quang xanh lá cây (GFP) đã được tìm thấy ngày càng nhiều. Bằng cách đưa các gen tương ứng vào plasmid hay DNA nhiễm sắc thể của một sinh vật quan tâm, các biểu hiện của GFP có thể được sử dụng để mô tả và quan sát hoạt động của promoter hoặc biểu 27
  13. gram dương và các vi khuẩn hình que. Các PNA có thể khắc phục được nhược điểm này. Nhờ bộ khung polyamide trung hòa về điện, nên các PNA khuếch tán qua thành tế bào kỵ nước và có thể phát hiện ngay các trực khuẩn gram dương mà không có bước xử lý sơ bộ nào. Sử dụng đầu dò đặc hiệu, các PNA được đánh dấu huỳnh quang, đã phân biệt được các vi khuẩn lao với các loại vi khuẩn khác trên các mẫu nuôi cấy trực khuẩn. Kỹ thuật này đã tạo ra những cải thiện trong chẩn đoán sơ bộ vi khuẩn lao và có thể giúp FISH trở thành một phương pháp hiệu quả, nhanh và có giá trị trong phân tích lâm sàng vi sinh vật. II. Tại Việt Nam Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền như: • ¾ Việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh những bất thường về cấu trúc và • số lượng nhiễm sắc thể của thai nhi. • ¾ Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền. • ¾ Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc. • ¾ Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư. Việc phát triển kỹ thuật FISH ởViệt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kỹthuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kỹ thuật của nước ta. Thứ nhất, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một kỹ thuật đơn giản, thời gian thực hiện ngắn và kết quả thu được rất chính xác, đồng thời phạm vi ứng dụng rất rộng. Thứ hai, đối với các phòng thí nghiệm nhỏ không có đầy đủ các thiết bị kỹ thuật cũng như trang bị riêng cần thiết cho các kỹ thuật khuếch đại phân tử di truyền có thể áp dụng phương pháp thay thế như lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) mà có thể kết hợp dễ dàng để lai tạo phân tử với kính hiển vi có trang bị hệ thống lọc đa sắc, một kỹ thuật quen thuộc với người nghiên cứu vi sinh. Ngược lai, 29
  14. E. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đồ án tìm hiểu kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 2. 3. fish-327 4. 5. 6. &hl=vi&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholart&sa=X&ei=MQAeVdGXEYf88QX_ 9ILgDw&ved=0CBoQgQMwAA 7. 31