Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish

Nội dung text: Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish

1. Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish ❖ Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. ❖ Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu. ❖ Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện & môi trường nuôi cấy. ❖ Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật. ❖ Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử . ❖ Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh.
2. Quy trình thực hiện • Dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vsv bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc biệt với các trình tự đặc hiểu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn ( không cần phá vỡ tế bào)
3. ➢Gần đây các trình tự đích khác như rRNA 23s,rRNA 18s hay mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm Fish. ➢rRNA 16 S được sử dụng vì ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc dc bán bảo toàn ➢đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác.
4. B2: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu 1. Xử lý bề mặt kính: phủ lớp chất tráng kính ngoài (gelatin/poly-L-lysine/các hc tạo muối) 2. Các tế bào sau giai đoạn xử lý cố định vào mặt kính 3. Điều kiện: môi trường tối ẩm, T°:27->50°C, thời gian lai: 30 phút -> vài giờ 4. Rửa bằng nước cất 2 lần 5. Sấy, cố định các p.tử lai ( có thể bổ sung các chất chống phai màu)
5. Nhược điểm kỹ thuật Fish Các chất tự phát huỳnh quang Kết quả không chính xác Đầu dò thiếu tính đặc hiệu Số lượng đầu dò quá ít Cấu trúc của đầu dò hay trình tự đích quá phức tạp Không thu được kết quả Hàm lượng RNA quá thấp Ảnh chụp bị mất màu
6. Ứng dụng của Fish ❖Fish được sử dụng trên toàn thế giới để nghên cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như môi trường dưới nước,trong đất hay trên bề mặt rễ thực vật. Vd: Khi sử dụng fish để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan. Loại vi khuẩn có hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA.
7. Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans(Moter et al., 2000)
8. Ứng dụng trong y học ❖ Nghiên cứu các quần thể vi khuẩn phức tạp trong cở thể người và động vật. dạ dày khoang miệng phổi
9. Nghiên cứu và phát hiện các bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida đối với các mầm bệnh suy giảm miễn dịch
10. Triển vọng của FISH ❖ Trên thế giới - Thực hiện hoàn toàn tự động, nhanh chóng chuẩn đoán chính xác vi sinh vật. - Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn.
11. ❖ Trên thế giới - Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng được đối với mRNA, một trình tự không ổn định và có số lượng bản sao thấp. - Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide.
12. ❖ Tại Việt Nam • Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kĩ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kĩ thuật của nước ta.