Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some marine toxic algae species in Vietnam

Nội dung text: Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some marine toxic algae species in Vietnam

1. Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some marine toxic algae species in Vietnam Luu Xuan Hoa Hanoi University of Science,VNU; Faculty of Biology Major: Genetics; Code: 60 42 70 Supervisors: Ass. Prof. Dr. Dinh Doan Long Date of Presenting Thesis: 2011 Abstract. Tổng quan về kỹ thuật FISH: khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH); tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam; các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ FISH; đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu. Nghiên cứu về vật liệu và phương pháp nghiên cứu: địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu; phương pháp thu và lưu giữ mẫu; phương pháp phân loại hình thái; phương pháp kiểm tra phân loại bằng AND và thiết kế đầu dò; phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ. Trình bày các kết quả nghiên cứu: kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái; ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu; kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu; tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò Keywords. Di truyền học; Kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang; Tảo độc; Biển Content MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ bằng phương pháp so sánh hình thái. Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu phân loại. Cùng với số lượng loài rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian. Những điều này đã gây cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng. Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) đã được phát triển. Kể từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà cả trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài. Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật. Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời
2. trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng nhất đã được tìm thấy. Kết quả thành công này có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp (Vũ Đình Quang và cộng sự, 2010). Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các loài sinh vật thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít. Trong một nghiên cứu gần đây tại Viện nghiên cứu hải sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2 loài tảo giáp độc hại A. tamarense và A. catenella, một số thử nghiệm đã được tiến hành. Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2 trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở thiết kế đầu dò. Tín hiệu huỳnh quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các loài tảo giáp từng gây khó khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH. Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong quan trắc cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại Việt Nam (Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự, 2011). PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm thu mẫu và đối tƣợng nghiên cứu Hai mẫu tảo độc hại được thu tại vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có: + Mẫu A. sp6 (Alexandrium affine) được thu vào ngày 20/7/2010 tại khu vực cửa biển thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phòng) với điều kiện môi trường như sau: độ mặn nước biển: 27‰, pH 7,72. + Mẫu A. sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) được thu vào ngày 27/4/2011 tại khu vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với các điều kiện môi trường nước biển như sau: độ mặn nước biển: 29‰, pH 7,44. 2.2. Phƣơng pháp thu và lƣu giữ mẫu Mẫu được thu bằng lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới 20µm, thu theo phương thẳng đứng. Mẫu sau đó được bảo quản trong lọ và giữ trong điều kiện nhiệt độ từ 4 – 15oC. Mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập (Hallegraeff và cộng sự, 1995; Anderson, 1995). 2.3. Phân lập các chủng vi tảo Theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng micropipet của Richmon (2004) và Andersen (2005): Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium). 2.4. Phƣơng pháp nuôi giữ các chủng vi tảo biển Theo Shoko và cộng sự (2005); Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự (2011): - Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon); - Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi đồng hồ đóng ngắt tự động; - Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24oC liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ; - Môi trường nuôi: IMK. 2.5. Phƣơng pháp phân loại hình thái Phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các tài liệu chính để phân loại là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004).
3. 3.1.2. Loài A. pseudogonyaulax Tấm 1’ hình 5 cạnh, không liên kết với lỗ bụng và có 1 lỗ bụng lớn tròn tiếp giáp với mép; ở một vài tế bào, lỗ bụng ở vị trí tiếp giáp của các tấm 1’-4’6” 3.2. Ảnh hƣởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu Trong điều kiện nuôi có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng 13 giờ sáng: 11 giờ tối) loài A. affine phát triển tốt nhất trong các chế độ nuôi cấy. Đối với loài A. pseudogonyaulax, kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện về độ mặn thuận lợi nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng với những điều kiện phòng thí nghiệm như đã nêu trên là ở 29‰. 3.3. Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu Ở mỗi mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C đã nhân được một đoạn ADN duy nhất có kích thước tương ứng với đoạn dự kiến. Vùng D1-D2 của mẫu L3 (xác định hình thái là A. affine) có kích thước gồm 651bp. Đối với mẫu L4 (xác định hình thái là A. pseudogonyaulax), vùng D1-D2 có trình tự bao gồm 650 bp. Kết quả phân tích BLAST 2 trình tự nói trên cũng đã khẳng định hai loài này là A. affine và A. pseudogonyaulax. 3.4. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ Phần mềm Bioedit được sử dụng để sắp xếp, so sánh với các trình tự tham khảo (từ NBCI) tại vùng tương đồng D1 - D2 của các loài thuộc chi Alexandrium. Những khác biệt từ các trình tự bảo thủ này so với các loài khác là cơ sở cho việc chọn lọc trình tự phù hợp để thiết kế đầu dò đặc hiệu cho từng loài. Kết quả sắp xếp và so sánh đối với loài A. affine tìm ra trình tự nucleotit từ vị trí 657 đến 676 phù hợp để thiết kế đầu dò. Trình tự đầu dò cho loài A. affine được xác định là: 5’-TGTAAGCTCTAGTAGGGTAG-3’. Tương tự như vậy, các kết quả so sánh đối với trình tự đoạn D1 – D2 của loài A. pseudogonyaulax cũng tìm được trình tự 774 đến 794 phù hợp cho thiết kế đầu dò đặc trưng cho loài này. Trình tự đầu dò được xác định là: 5’-ACAGCTGACAATCGCAA TTG-3’. Các trình tự này sau đó được đặt sản xuất bởi công ty TOS (Nhật Bản) với điều kiện có gắn tín hiệu Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) vào đầu 5’ để phục vụ cho các thí nghiệm lai huỳnh quang tiếp theo. 3.5. Tối ƣu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò Trên cơ sở đầu dò thiết kế được, các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ kiểm tra cho 2 loài A. affine và A. pseudogonyaulax đã được tiến hành. Kết quả thử nghiệm cho thấy, có sự tương đối giống nhau về nhiệt độ lai lai đối với cả 2 đầu dò trên hai đối tượng vi tảo.
4. - Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). - Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol)). Lai tế bào ở 43°C trong 5 phút. Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần: - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon. Tổng thời gian thao tác cho quá trình này đã được tính toán là khoảng 2,5 giờ. Điều này cho phép các thí nghiệm nghiên cứu phát hiện các loài vi tảo biển độc hại chính xác, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp phân tích truyền thống bằng hình thái trước đây. KẾT LUẬN Chúng tôi đã rút ra được một số kết luận chính sau từ nghiên cứu này: 1. Đã xác định trình tự gen vùng mã hóa cho đoạn D1 – D2 của tiểu phần lớn (LSU) thuộc ribosome của hai loài tảo giáp độc hại A. affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam. 2. Đã thiết kế và thử nghiệm thành công hai đầu dò phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với hai loài tảo độc A. affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam. Các đầu dò hoạt động tốt trên cả mẫu nuôi cấy và mẫu thu ngoài tự nhiên và các đầu dò đảm bảo tính đặc hiệu của loài. 3. Đã ứng dụng thành công kỹ thuật FISH trong việc xác định nhanh chóng và chính xác 2 loài tảo độc hại biển Việt Nam nói trên, làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp quan trắc, đánh giá nhanh môi trường biển, nghiên cứu dự đoán diễn biến thủy triều đỏ tại các vùng ven biển Việt Nam sau này. KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu và thiết kế thêm các đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác trong các vùng biển và ven biển Việt Nam. Cần có các nghiên cứu, ứng dụng các kỹ thuật di truyền trong việc quan trắc, phân loại nhanh đối với các loài vi tảo biển Việt Nam nhằm có thể theo dõi thường xuyên, đánh giá nhanh những biến đổi môi trường gây thủy triều đỏ do tảo biển độc hại gây ra, hạn chế thiệt hại trong nuôi trồng thủy sản ven biển. References Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học thực hành, 11, tr. 9-11.
5. 19. Bouvier T., Del G. (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol. Ecol., 44, pp. 3 – 15. 20. Cho E. S., Hur H. J., Byun H. S., Lee S. G., Rhodes L. L., Jeong C. S. and Park J. G.(2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea. Bot. Mar., 45, pp. 364 - 372. 21. Choi, B. K. (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis”. Infect. Immun., 62, pp. 1889 – 1895. 22. Choong J. K., Yoshihiko S. (2005), “Molecular identification of toxic Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp. 984 - 991. 23. Deere, D. (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett. Appl. Microbiol., 27, pp. 352 – 356. 24. DeLong, E. F. (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells”, Science, 243, pp. 1360 –1363. 25. DeLong E. F., Taylor L. T., Marsh T. L. and Preston C. M. (1999), “Visualization and enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp. 5554 - 5563. 26. Felske, A. (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch grassland soils”, Appl. Environ. Microbiol., 64, pp. 4588 – 4590. 27. Fuchs B. M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R. (2000), “In situ accessibility of Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl. Environ. Microbiol., 67, pp. 961 – 968. 28. Gersdorf H. (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from patients with advanced periodontitis”, J. Clin. Microbiol., 31, pp. 941 – 946. 29. Gersdorf, H. (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram- negative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 6, pp. 109 – 114. 30. Glockner, F. O. (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria”, Syst. Appl. Microbiol., 19, pp. 403 – 406. 31. Glöckner F. O., Fuchs B. M. and Amann R. (1999), “Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl. Environ. Microbiol., 65, pp. 3721 - 3726.Hallegraeff G. M., Anderson D. M., Cembella A. D., Enevoldsen H. O. (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”, UNESCO, 33, 794p. 33. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 818 – 825. 34. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol. 38, pp. 818 – 825. 35. Hougaard D. M., Hansen H. and Larsson L. I. (1997), “Non-radioactive in situ hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”, Histochem. Cell Biol., 108, pp. 335 - 344. 36. Inacio J., Beherens S., Fuchs B. M., Fonseca A., Spencer M. I., Amann R. (2003), “In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3-labeled oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains”, Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 2899 – 2905. 37. Jansen, G. J. (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 814 – 817.
6. 56. Puvion D., and Puvion E., (1996), “Non-isotopic electron microscope in situ hybridization for studying the functional sub-compartmentalization of the cell nucleus”, Histochem. Cell Biol., 106, pp. 59 - 78. 57. Richmon, A. (2004), “Handbook of Microalgal culture: Biotechnology and Applied Phycology”, Blackwell Science, 577p. 58. Rudkin G. T., and Stollar B. D. (1977), “High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence”, Nature, 265, pp. 472-473. 59. Scholin C., Miller P. E., Buck K., Chavez F., Harris P., Haydock P., Howard J. (1997), “Detection and quantification of Pseudo-nitzschia australis in cultured and natural populations using LSU rRNA-targeted probes”, Limnol. Oceanogr. 42(5), pp. 1265 –1272. 60. Shoko H. T., Sako Y. (2005), “Rapid detection of natural cells of Alexandrium tamarense and A. catenella (Dinophyceae) by fluorescence in situ hybridization”, Harmful Algae, 4, pp. 319 – 328. 61. Singer R. H., and Ward D. C. (1982), “Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog”, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, pp. 7331 - 7335. 62. Sebatián C. R., and Ryan C. O’. (2001), “Single-cell sequencing of dinoflagellate (Dinophyceae) nuclear ribosomal genes”, Molecular Ecology Resources, 1(4), pp. 329-331. 63. Tanabe S. H., Sako Y. (2006), “Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater”, Fishersies science, 72(1), pp. 77 - 82. 64. Trebesius K., Amann R., Ludwig W., Mühlegger K., and Schleifer K. (1994),“ Identification of whole fixed bacterial cells with nonradioactive 23S rRNA-targeted polynucleotide probes”, Appl. Environ. Microbiol. 60, pp. 3228 - 3235. 65. Wagner M., Schmid S. J., Trebesius K., Bubert A., Goebel W., and Schleifer K. (1998), “In situ detection of a virulence factor mRNA and 16s rRNA in Listeria monocytogenes”, FEMS Microbiology Letters, 160, pp. 159 - 168. 66. Werner M., Rudolf A., Wolfgang L., Marc V., and Karl H. S. (1996), “Application of a suite of 16s rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment”, Microbiology, 142, pp. 1097 – 1106. 67. Yamaguchi, N. (1996). “Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy-3-naphthoic acid-29-phenylanilide phosphate and Fast Red TR in situ hybridization”, Appl. Environ. Microbiol., 62, pp. 275–278. 68. Ylmaz L. S., Hatice E. O., Noguera D. R. (2005), “Making all parts of the 16S rRNA of Escherichia coli accessible in situ to single DNA oligonucleotides”, Appl. Environ. Microbiol., 72, pp. 733 – 744. 69. Zarda, B. (1991), “Identification of single bacterial cells using digoxigeninlabelled, rRNA-targeted oligonucleotides”, J. Gen. Microbiol., 137, pp. 2823 – 2830.